Investigadores de la Universidad de Missouri (Estados Unidos) y sus colaboradores ubicaron un marcador eficaz para la edición genética en el arroz. El equipo presentó un nuevo enfoque que utiliza un marcador diferente basado en un gen que hace a las plantas resistentes a una toxina. Probaron tres genes que están relacionados a esta toxina denominada fitotoxina metilviológeno (MV) como método de selección en el cultivo de arroz y descubrieron que OsLAT5 es un marcador eficaz para el arroz. Este enfoque ahorra espacio dentro del genoma y evita problemas de silenciamiento, también permite rastrear con éxito las modificaciones simplemente comprobando la resistencia a la toxina.

Actualmente, los científicos utilizan herramientas como TALENs, CRISPR y edición primaria para modificar los genes de las plantas. Tradicionalmente, el gen que codifica la enzima de edición, el ARN guía y los marcadores de selección se introducen en el ADN durante la transformación de la planta, el cual suele estar formado por un casete que consta de un potente promotor ubicuo de la planta, un gen de resistencia a antibióticos o herbicidas y un terminador. Los casetes marcadores seleccionables son comparativamente grandes, utilizando una fracción sustancial de la capacidad del ADN-T de Agrobacterium, que limita el número efectivo de TALEN o ARN guía, pudiendo además silenciar otros genes.

El estudio se planteó la hipótesis de que se puede crear un marcador seleccionable editando el rasgo endógeno de la planta huésped. Idealmente, la pérdida de una determinada función génica que conduciría a la adquisición de un nuevo rasgo, es decir, la resistencia a un producto químico, metabolito o xenobiótico.

Estos marcadores de pérdida de función generados por la edición, excluirían la necesidad de eliminar el marcador de herbicida y podrían utilizarse también para los enfoques de edición del genoma libre de transgenes.

El viológeno de metilo (MV; marca registrada paraquat; (PQ) se identificó en un miembro de la familia de transportadores de aminoácidos (LAT) de tipo L de Arabidopsis (SLC7A5), denominado RMV1 (resistente al viológeno de metilo) que está implicado en el transporte transmembrana de poliaminas (PA) el 22,23]. Los genes que codifican los transportadores de aminoácidos de tipo L se identificaron varias veces de forma independiente y se denominaron RMV, LAT, PUT (Transportador de captación de poliaminas), LHR (Menor expresión del gen sensible al calor) o PAR (resistente al paraquat) [24]. El genoma del arroz contiene nueve parálogos de LAT/PUT/PAR.

En el estudio se identificó que el ARNi de OsLAT5/OsPUT3/OsPAR1 causó resistencia parcial a MV, lo que resultó en una reducción del contenido de clorofila (≈ 20-35%) cuando las plantas fueron tratadas con las concentraciones relativamente altas de MV (5 μM).

Las líneas de arroz de ARNi o silenciadas tenían un peso de grano normal y no mostraban diferencias fenotípicas detectables en comparación con los controles de tipo salvaje, incluso en condiciones de crecimiento en el campo, lo que indica que la eliminación del locus OsLAT5/OsPUT3/OsPAR1 no tiene efectos perjudiciales sobre el crecimiento y desarrollo del arroz.

La generación de mutaciones de pérdida de función mediante la edición en el  único locus OsLAT5/OsPUT3/OsPAR1 es suficiente para obtener resistencia a MV, y se demostró que MV se puede utilizar como un marcador seleccionable durante la inducción del callo y la regeneración de plantas a partir de callos para identificar transformantes o en etapa de plántula para detectar líneas que llevan el locus editado.

Para detectar mutaciones, se tomaron muestras de plantas T0 y de generaciones sucesivas para la extracción de ADN, y se utilizaron cebadores específicos de genes para la amplificación de fragmentos genómicos relevantes, se identificaron los amplicones que perdieron los sitios de restricción y se determinaron por secuenciación de Sanger las mutaciones, posteriormente las plántulas portadoras de mutaciones en los genes diana se cultivaron hasta la madurez para la multiplicación de semillas y su posterior selección.

Nuestros datos indican que la interrupción de un solo gen transportador de captación de poliaminas en el arroz, es decir, LAT5/PUT3/PAR1, es suficiente para proporcionar resistencia a MV. Además, se demostró que la selección basada en MV se puede realizar en tejidos de arroz fotosintéticamente activos, por ejemplo, semillas en germinación y plántulas jóvenes.

La generación de mutaciones con pérdida de función mediante la edición en el único locus OsLAT5/OsPUT3/OsPAR1 es suficiente para obtener resistencia a MV y este marcador seleccionable podría implementarse para enfoques de edición del genoma dependientes y libres de transgenes, pudiéndose adaptar fácilmente para generar selección ortogonal en otras plantas, incluidas Arabidopsis y cultivos, concluyeron los investigadores.

Fuente: ISAAA

Estudio: Mutación de pérdida de función en el gen transportador de poliaminas OsLAT5 como marcador seleccionable para la edición del genoma